操作指南

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                              液體細菌或細胞原位核酸雜交
                              作者:Exon 發布于:2021/1/10 17:40:47 點擊量:

                              原位雜交可以用于對培養細胞、水細菌、淤泥、糞便等,對細菌鑒定、細胞、計數,成為分子系統發育鑒別或基因表達分析的有力工具。然而,在液體中也可以對細胞、革蘭氏陽、陰性細菌、某些環境細菌樣品進行均勻核酸雜交,然后進行FISH、流式、顯微鏡觀察分析面。開展溶液原位雜交的檢測,在懸液中完成。在培養細胞、微生物中能區分多種細菌,包括芽孢桿菌,變形菌及分析細胞基因的表達。

                              試劑:抗熒光衰減試劑(DAPI)、乙醇(50%,85%,95%、100%,冷存,固定)、FISH固定液、FISH雜交液、細菌培養基、標記的核苷酸探針、磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)(pH 7.4)、20XSSC0.1X,pH 7.0

                              設備:鋁箔、蓋玻片、離心機、移液器、吸頭、顯微鏡、熒光顯微鏡(適當濾光片)、透明指甲油或抗熒光封片劑、分光光度計、培養管、微型離心管、水浴鍋或雜交儀。

                              培養的細胞

                              1.將細胞接種到培養瓶,在指數最佳生長時候,進行細胞計數觀察,將適當細胞密度用于比較雜交。

                              2.丟棄上清液,并將細胞用胰蛋白酶消化完全重新懸浮在1 mlpH 7.41X PBS中。

                              3.3,000 g離心5 min,丟棄上清液。

                              4.500 µl 1X PBSpH 7.4)中重新懸浮細胞。

                              5.500 µl100%乙醇,將試管儲存在20°C。固定細胞可在20°C下儲存數月。

                              6.雜交之前,3000g,5 min使細胞顆;瘲壣锨逡,去除殘留乙醇。

                              革蘭氏陽性細菌固定

                              1. 細菌培養物,接種2 ml肉湯培養物并在最佳生長溫度、培養基和培養條件下培養。培養后,進行細胞計數(或OD600分光光度計讀數),以便將適當細胞密度用于比較雜交。

                              2. 在對數生長期(OD600 0.4-1.0),以13,000 g離心5 min獲取細菌。在生長的對數期收集的細胞將提供較好的信號。如果需要,使用較大規模培養,但小規模的培養物也能為FISH提供足夠的細胞數量。

                              3.丟棄上清液,并將細胞完全重新懸浮在1 mlpH 7.41X PBS中。

                              4.13,000 g離心5 min,丟棄上清液。

                              5.500 µl 1X PBSpH 7.4)中重新懸浮細胞。

                              6.500 µl100%乙醇,將試管儲存在20°C。固定細胞可在20°C下儲存數月。

                              7.雜交之前,以13,000g,5 min使細胞顆;瘲壣锨逡。從細胞顆粒中去除殘留乙醇。

                              革蘭氏陰性細菌固定

                              1.對于每個細菌培養物,接種2 ml肉湯培養物,在培養基中以最佳生長溫度培養過夜。培養完成后,進行細胞計數(或OD600分光光度計讀數),以合適細胞密度用于比較雜交。

                              2.將每種培養物轉移到2 ml微型離心管中,以13,000 g離心5 min。丟棄上清液。

                              3.在每管1 ml FISH用固定液中重新懸浮細胞顆粒,并在室溫下培養3 h。

                              4.13,000g離心細胞混合物5 min并丟棄上清液。

                              5.通過50%乙醇重新懸浮并在室溫下孵育5 min,洗滌細菌。

                              6.13,000 g離心試管2 min,丟棄上清液。

                              7.80%95%的乙醇重復步驟12-13。

                              8.通過吸引器或將試管置于快速真空干燥機中干燥細胞顆粒10 min。固定后可在4°C下儲存1個月。

                              環境樣品固定

                              對于環境樣品,有必要包括未與標記探針孵育的樣品,以評估樣本的自發熒光。

                              1.盡可能使環境樣品均勻化,減少聚集對獲得探針可接近的單細胞懸浮液的不利影響。在雜交之前通過離心分離細胞或洗滌環境樣品。

                              2.根據目標種群類別,對細菌固定方案。如果環境樣品很可能含有革蘭氏陰性和陽性細菌的混合物,并且有必要與針對革蘭氏陰性和陽性細胞的探針雜交,那么在雜交之前,樣品可用兩次不同方法固定。

                              預雜交與雜交。

                              1.將固定細胞重新懸浮在500 µl FISH雜交溶液中,在37°C下培養30 min。完成后移除一份預雜交混合物的子樣本(如50 µl)進行雜交。每個樣品都能進行多次雜交,減少每個反應所需的探針。

                              2.混合物中加入熒光標記的寡核苷酸探針。

                              探針濃度應根據經驗決定。幾個因素可影響所需探針數量:探針靈敏度、樣品密度和雜交時間。根據經驗,將5 µl 100 ng/µl探針加到50 µl預雜交液,中可產生一致且均勻的熒光。

                              3.37°C65°C避光處雜交或用鋁箔覆蓋試管孵育2-3 h。如使用多個探針,建議65下進行雜交。根據所用探針和樣品性質。根據經驗42°C,改變甲酰胺濃度,可以達到所需的雜交效果。

                              4.13,000 g離心混合物5 min并丟棄上清液。

                              5.通過在20 µl 0.1X SSC中重新懸浮細胞顆粒以清洗細胞,并在37°C的黑暗中培養15 min。

                              6.13,000 g離心混合物5 min并丟棄上清液。

                              7.重復步驟22-23兩次。

                              8.20 µl 0.1X SSC中重新懸浮洗滌過的細胞顆粒。

                              9.在載玻片上制備樣品:

                              i. 10 µl樣品轉移到用乙醇清洗過的顯微鏡載玻片上。

                              iv. 儲存載玻片于黑暗中。在觀察前可在4°C的黑暗中保存至多1 周。

                              10.通過流式檢測,選擇正確的流式光源通道。

                               

                              實驗問題:

                              1. 雜交溫度:更低的溫度會導致探針雜交增加,但也會降低特異性。

                              2.去離子甲酰胺濃度:可能需要低濃度的甲酰胺。一般情況下,0%-40%的甲酰胺尋找合適的范圍濃度。

                              3.探針濃度:根據給定探針對靶區的可達性,可能需要更多的探針進行充分雜交。

                              4.洗滌步驟中使用的SSC濃度:使用1X SSC代替0.1X SSC將降低洗滌步驟的嚴密性。

                              5.洗滌溫度:37°C通常被認為是最佳洗滌溫度,但以5°C為增量降低溫度可以操縱洗滌條件的嚴密性。

                              6.洗滌步驟的次數:減少洗滌步驟的次數會降低雜交的嚴密性。但是,不建議進行少于兩次的洗滌。

                              7.雜交混合物或制備的載玻片的儲存條件:如果雜交混合物或制備的載玻片未在黑暗中儲存或觀察前的儲存時間超過了建議的時長,則可能發生熒光降解。

                              8.探針沒有與所需的細菌細胞特異性雜交。上述降低雜交嚴密性的因素也可以調整,以產生更嚴密的雜交反應。增加雜交和洗滌溫度以及洗滌步驟的次數,將增加探針雜交的特異性和洗滌的嚴密性。雜交溶液中甲酰胺的含量也可以增加(不超過40%),分別修改上述變量,以確定理想的雜交條件。

                              9.熒光信號過大或有光漂白現象。如果觀察到過量熒光或出現光漂白,應考慮以下因素:1細胞密度:在雜交反應中使用過多的細胞會使視場擁擠,難以觀察到個體細胞。2制備的載玻片的存放:制備好的載玻片應立即存放在黑暗中,直到觀察開始,并且在觀查過程中應盡快拍攝圖像。

                               

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