檢測服務

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                              (1)外顯子生物實驗室提供: Pull down RNA探針標記服務;價格:3500元,10-20T,備注:小于2000bp。

                              (2)提供:RNA標記生物素,以便于開展Pull down實驗。

                              (3)標記原理:通過T3、T7轉錄獲得互補的RNA,然后,進行3端標記,將生物素標記在RNA上;

                              (4)獲得的RNA探針,用于Pown down實驗。

                              附說明書:


                              磁珠法RNA-Protein Pull-Down 試劑盒(V5.3

                              貨號:R5126    本試劑盒室溫運輸,儲存于4°C

                              試劑盒成份:

                              (一)蛋白-RNA富集試劑盒(25TR5126-1,儲存于4°C

                              1Streptavidin 磁珠:1mL, 10mg/mL;

                              2RNA捕獲溶液:10mL, 20mM Tris pH 7.5, 1M NaCl, 1mM EDTA

                              320mM Tris, 5mL, pH 7.5

                              4)蛋白-RNA結合溶液(10X)1mL,0.2M Tris pH 7.5, 0.5M NaCl, 20mM MgCl2, 1% Tween-20

                              5)洗液(1X), 10mL, 20mM Tris (pH 7.5), 10mM NaCl, 0.1% Tween-20

                              6Biotin Elution Buffer, 1.5mL

                              750%無菌甘油, 0.5mL

                              8HuR Monoclonal Antibody, 50μL, For Western blots10T

                              (二)探針對照:R5126-2,儲存于-20°C

                              Positive AR RNA Probe10μM, 25μL, 5Test。

                              5´-CUGGGCUUUUUUUUUCUCUUUCUCUCCUUUCUUUUUCUUCUUCCCUCCCUA-3´

                              Negative RNA (A)25 Probe25μL, 5Test。

                              試劑盒介紹:

                              磁珠法RNA-蛋白質沉淀試劑盒,利用鏈霉親和素磁珠鏈接到生物素標記的RNA,形成磁珠探針,生物素標記的RNA探針與目的蛋白(RBP)結合。磁珠-親和素-生物素化RNA與蛋白形成復合物。通過磁珠分離出來。該試劑盒包括:各種緩沖液,標記生物的陽性對照、陰性對照,適合下游檢測如蛋白質印跡(WB)和質譜(MS)。
                              對照原理:陽性RNA對照系統:利用3'非翻譯區雄激素受體(ARRNA,AR RNA的近端3´非翻譯區(UTR)包含HuRPolyC)結合蛋白(CP1CP2)的UC富集區。這些RNA結合蛋白調節mRNA穩定性,一般細胞都應該呈現陽性。陰性對照polyA25 RNA和哺乳動物細胞裂解液mRNA不結合,也不包含HuRpolyCBP結合位點。

                               

                              簡略步驟

                              本試劑盒的蛋白的富集程序已經過優化,步驟原理下圖。首先將生物素標記的RNA結合到磁珠上,以使生物素的RNA定向結合特異性蛋白質。親和素的磁珠與生物素的RNA結合。將結合RNA的磁珠在蛋白質-RNA結合緩沖液中平衡。通過添加適當的緩沖液,渦旋并在磁力架上分離,洗滌磁珠。接著使用SDS-PAGE上樣緩沖液洗脫樣品,然后進行后續檢測。

                              注意事項-1:準備工作

                              1)制備目的RNA、純化,然后自行標記生物素或直接聯系我們,外顯子生物提供RNA探針的制備和標記,價格280040-50次;
                              2)金屬浴或水浴鍋;
                              3)氯仿:異戊醇(241、無水乙醇;
                              4)細胞裂解液,外顯子實驗室可提供;
                              5)洗脫緩沖液:SDS PAGE上樣緩沖液;
                              6)含0.05Tween-20洗滌劑的TBS-T溶液;
                              71.5ml磁珠分離架,外顯子生物實驗室有售,250/個;
                              8)蛋白質印跡用的PVDF、HRP山羊抗小鼠IgGH+L、WB化學發光底物。

                              注意事項-2:實驗過程

                              1)生物素RNA作為探針是本實驗的關鍵。
                              2)操作使用標記的RNA時,請保持無核酸酶的環境。戴上手套,口罩防止RNA酶。
                              3)不要冷凍或干燥鏈霉親和素磁珠,冷凍或干燥會導致珠粒聚集,失去活性。
                              4)為了減少蛋白質降解,在細胞裂解液制備中加入蛋白酶抑制劑。
                              5)將SDS-PAGE還原樣品緩沖液中的磁珠煮沸時,沸騰使磁珠失去結合活性不能重復使用。

                               

                              詳細步驟

                              第一步 親和素磁珠的準備
                              1)保持無核酸酶的條件,用0.1% DEPC溶液噴灑或擦拭清潔工作區域,戴手套,口罩;
                              2)取出磁珠,旋轉10秒,將磁珠重懸,吸取100μl,然后轉移至無核酸酶的離心管內。
                              3)將試管放在磁力架上,磁珠自動保留到試管側面。用200ul0.1M NaOH,50mM NaCl(無核酸酶)洗滌磁珠兩次。在100mM NaCl中洗滌一次,溶解平衡磁珠備用。
                              第二步 裂解細胞(同WB,注意裂解蛋白濃度)
                              1)將細胞加入裂解液,確保細胞裂解物蛋白,濃度務必大于2.0mg / mL,方便在使用結合反應緩沖液時,保證其影響不大。如果裂解物中鹽多,可以透析或者用鹽離子洗脫柱。

                              第三步.標記的RNA與鏈霉親和素磁珠結合
                              1)每50μL磁珠結合100pmol RNA左右,以下說明使用50pmol RNA50μL磁珠。
                              2)試劑盒包括陽性和陰性RNA對照。為確定用戶RNA蛋白結合的特異性,第一次請使用

                              陽性,陰性對照。
                              3)在1.5mL微量離心管中加入50μL的鏈霉親和素磁珠。放入磁力架中,磁珠靠在試管

                              的側面,丟棄上清液。
                              4)用等體積的20mM TrispH 7.5)洗滌,渦旋重懸珠。重復步驟洗滌一次。
                              5)于磁力架上,磁珠收集在試管側面,丟棄上清。加入50uL 1X RNA Capture Buffer。
                              6)將50pmol的標記RNA添加到珠子中,輕輕混合。室溫下攪拌孵育15-30分鐘。
                              第四步.RNA結合蛋白與RNA結合
                              1)將試管放入磁力架中,使磁珠靠在試管的側面,丟棄上清液。用等體積的20mM TrispH 7.5)洗滌,渦旋重懸珠。
                              2)重復步驟(1)。
                              3)將試管放入磁力架中,磁珠靠在試管的側面,棄上清液。將10XRNA-蛋白質結合緩沖液稀釋至1X(即19超純水稀釋)。將100μL 1X蛋白質-RNA結合緩沖液添加到磁珠混合。

                              4準備RNA-蛋白質結合反應的預混液:
                              10X
                              蛋白質-RNA結合緩沖液      10       5-20微升
                              50
                              %甘油                      30       0-50微升
                              其他鹽等(可變)               X       體積
                              裂解液(蛋白質濃度2mg / mL     1-30    20-200微克
                              無核酸酶的水                 100    100μL
                              5)將試管放入磁力架中,以將磁珠收集在側面,丟棄上清液。
                              6)將100μL的預混液添加到結合
                              RNA的磁珠中,通過移液器或輕輕渦旋混合。
                              7)在4°C下攪拌或旋轉孵育60分鐘。
                              第五步. RNA結合蛋白復合物的洗滌和洗脫
                              1)將試管放入磁力架中,使磁珠靠在試管的側面。將上清液轉移到試管中以備后用。
                              2)用等體積的1X洗滌緩沖液(100μL)洗滌。
                              3)再重復兩次步驟12。如果需要,請保存洗滌上清液以進行分析。
                              4)將試管放入磁力架中,使珠子靠在試管的側面。將上清液轉移到試管中以備后用。
                              5)向珠中加入50μL洗脫緩沖液,并渦旋混合均勻。于37°C攪拌孵育15-30分鐘。
                              6)將試管放入磁力架中,以將磁珠收集在試管側面。除去上清液用于下游分析。
                              7)如果下游應用是蛋白質印跡,將原樣品緩沖液添加至樣品至1X。
                              9)在95-100°C下加熱洗脫的樣品5-10分鐘。電泳凝膠上或在-20°C儲存直至使用。
                              10)對于對照反應,每泳道加30μL。

                              第六步.蛋白質印跡分析
                              注意:細胞裂解物泳道作為對照,以驗證蛋白質印跡是否正常運行。
                              1.
                              通過SDS-PAGE分離蛋白質,并轉移到硝酸纖維素膜上。
                              2.
                              在室溫下,將膜在含有5%牛血清白蛋白(BSA)的TBS-T中封閉1小時。
                              3.
                              準備在10mL5BSATBS-T中包含10μLHuR抗體(36kDa)的溶液。
                              4.
                              在室溫下將膜在抗HuR抗體中孵育4小時,或在4°C過夜。
                              5.
                              TBS-T清洗膜5次,每次5分鐘。
                              6.
                              將山羊抗小鼠IgGH + L)(HRP共軛,120,000)稀釋到含有5BSATBS-T中。
                              7.
                              將膜在稀釋的山羊抗小鼠IgG中于室溫孵育1小時。
                              8.
                              TBS-T清洗膜5次,每次5分鐘。
                              9.
                              將膜與化學發光底物在室溫下孵育(例如,SuperSignal West Pico化學發光底物)。
                              10.
                              立即將膠片暴露在X射線膠片或CCD相機上進行適當的曝光。





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