檢測服務

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(1)外顯子生物實驗室提供: Pull down RNA探針標記服務;價格:3500元,10-20T,備注:小于2000bp。

(2)提供:RNA標記生物素,以便于開展Pull down實驗。

(3)標記原理:通過T3、T7轉錄獲得互補的RNA,然后,進行3端標記,將生物素標記在RNA上;

(4)獲得的RNA探針,用于Pown down實驗。

附說明書:


磁珠法RNA-Protein Pull-Down 試劑盒(V5.3

貨號:R5126    本試劑盒室溫運輸,儲存于4°C

試劑盒成份:

(一)蛋白-RNA富集試劑盒(25TR5126-1,儲存于4°C

1Streptavidin 磁珠:1mL, 10mg/mL;

2RNA捕獲溶液:10mL, 20mM Tris pH 7.5, 1M NaCl, 1mM EDTA

320mM Tris, 5mL, pH 7.5

4)蛋白-RNA結合溶液(10X)1mL,0.2M Tris pH 7.5, 0.5M NaCl, 20mM MgCl2, 1% Tween-20

5)洗液(1X), 10mL, 20mM Tris (pH 7.5), 10mM NaCl, 0.1% Tween-20

6Biotin Elution Buffer, 1.5mL

750%無菌甘油, 0.5mL

8HuR Monoclonal Antibody, 50μL, For Western blots10T

(二)探針對照:R5126-2,儲存于-20°C

Positive AR RNA Probe10μM, 25μL, 5Test。

5´-CUGGGCUUUUUUUUUCUCUUUCUCUCCUUUCUUUUUCUUCUUCCCUCCCUA-3´

Negative RNA (A)25 Probe25μL, 5Test。

試劑盒介紹:

磁珠法RNA-蛋白質沉淀試劑盒,利用鏈霉親和素磁珠鏈接到生物素標記的RNA,形成磁珠探針,生物素標記的RNA探針與目的蛋白(RBP)結合。磁珠-親和素-生物素化RNA與蛋白形成復合物。通過磁珠分離出來。該試劑盒包括:各種緩沖液,標記生物的陽性對照、陰性對照,適合下游檢測如蛋白質印跡(WB)和質譜(MS)。
對照原理:陽性RNA對照系統:利用3'非翻譯區雄激素受體(ARRNA,AR RNA的近端3´非翻譯區(UTR)包含HuRPolyC)結合蛋白(CP1CP2)的UC富集區。這些RNA結合蛋白調節mRNA穩定性,一般細胞都應該呈現陽性。陰性對照polyA25 RNA和哺乳動物細胞裂解液mRNA不結合,也不包含HuRpolyCBP結合位點。

 

簡略步驟

本試劑盒的蛋白的富集程序已經過優化,步驟原理下圖。首先將生物素標記的RNA結合到磁珠上,以使生物素的RNA定向結合特異性蛋白質。親和素的磁珠與生物素的RNA結合。將結合RNA的磁珠在蛋白質-RNA結合緩沖液中平衡。通過添加適當的緩沖液,渦旋并在磁力架上分離,洗滌磁珠。接著使用SDS-PAGE上樣緩沖液洗脫樣品,然后進行后續檢測。

注意事項-1:準備工作

1)制備目的RNA、純化,然后自行標記生物素或直接聯系我們,外顯子生物提供RNA探針的制備和標記,價格280040-50次;
2)金屬浴或水浴鍋;
3)氯仿:異戊醇(241、無水乙醇;
4)細胞裂解液,外顯子實驗室可提供;
5)洗脫緩沖液:SDS PAGE上樣緩沖液;
6)含0.05Tween-20洗滌劑的TBS-T溶液;
71.5ml磁珠分離架,外顯子生物實驗室有售,250/個;
8)蛋白質印跡用的PVDF、HRP山羊抗小鼠IgGH+L、WB化學發光底物。

注意事項-2:實驗過程

1)生物素RNA作為探針是本實驗的關鍵。
2)操作使用標記的RNA時,請保持無核酸酶的環境。戴上手套,口罩防止RNA酶。
3)不要冷凍或干燥鏈霉親和素磁珠,冷凍或干燥會導致珠粒聚集,失去活性。
4)為了減少蛋白質降解,在細胞裂解液制備中加入蛋白酶抑制劑。
5)將SDS-PAGE還原樣品緩沖液中的磁珠煮沸時,沸騰使磁珠失去結合活性不能重復使用。

 

詳細步驟

第一步 親和素磁珠的準備
1)保持無核酸酶的條件,用0.1% DEPC溶液噴灑或擦拭清潔工作區域,戴手套,口罩;
2)取出磁珠,旋轉10秒,將磁珠重懸,吸取100μl,然后轉移至無核酸酶的離心管內。
3)將試管放在磁力架上,磁珠自動保留到試管側面。用200ul0.1M NaOH,50mM NaCl(無核酸酶)洗滌磁珠兩次。在100mM NaCl中洗滌一次,溶解平衡磁珠備用。
第二步 裂解細胞(同WB,注意裂解蛋白濃度)
1)將細胞加入裂解液,確保細胞裂解物蛋白,濃度務必大于2.0mg / mL,方便在使用結合反應緩沖液時,保證其影響不大。如果裂解物中鹽多,可以透析或者用鹽離子洗脫柱。

第三步.標記的RNA與鏈霉親和素磁珠結合
1)每50μL磁珠結合100pmol RNA左右,以下說明使用50pmol RNA50μL磁珠。
2)試劑盒包括陽性和陰性RNA對照。為確定用戶RNA蛋白結合的特異性,第一次請使用

陽性,陰性對照。
3)在1.5mL微量離心管中加入50μL的鏈霉親和素磁珠。放入磁力架中,磁珠靠在試管

的側面,丟棄上清液。
4)用等體積的20mM TrispH 7.5)洗滌,渦旋重懸珠。重復步驟洗滌一次。
5)于磁力架上,磁珠收集在試管側面,丟棄上清。加入50uL 1X RNA Capture Buffer。
6)將50pmol的標記RNA添加到珠子中,輕輕混合。室溫下攪拌孵育15-30分鐘。
第四步.RNA結合蛋白與RNA結合
1)將試管放入磁力架中,使磁珠靠在試管的側面,丟棄上清液。用等體積的20mM TrispH 7.5)洗滌,渦旋重懸珠。
2)重復步驟(1)。
3)將試管放入磁力架中,磁珠靠在試管的側面,棄上清液。將10XRNA-蛋白質結合緩沖液稀釋至1X(即19超純水稀釋)。將100μL 1X蛋白質-RNA結合緩沖液添加到磁珠混合。

4準備RNA-蛋白質結合反應的預混液:
10X
蛋白質-RNA結合緩沖液      10       5-20微升
50
%甘油                      30       0-50微升
其他鹽等(可變)               X       體積
裂解液(蛋白質濃度2mg / mL     1-30    20-200微克
無核酸酶的水                 100    100μL
5)將試管放入磁力架中,以將磁珠收集在側面,丟棄上清液。
6)將100μL的預混液添加到結合
RNA的磁珠中,通過移液器或輕輕渦旋混合。
7)在4°C下攪拌或旋轉孵育60分鐘。
第五步. RNA結合蛋白復合物的洗滌和洗脫
1)將試管放入磁力架中,使磁珠靠在試管的側面。將上清液轉移到試管中以備后用。
2)用等體積的1X洗滌緩沖液(100μL)洗滌。
3)再重復兩次步驟12。如果需要,請保存洗滌上清液以進行分析。
4)將試管放入磁力架中,使珠子靠在試管的側面。將上清液轉移到試管中以備后用。
5)向珠中加入50μL洗脫緩沖液,并渦旋混合均勻。于37°C攪拌孵育15-30分鐘。
6)將試管放入磁力架中,以將磁珠收集在試管側面。除去上清液用于下游分析。
7)如果下游應用是蛋白質印跡,將原樣品緩沖液添加至樣品至1X。
9)在95-100°C下加熱洗脫的樣品5-10分鐘。電泳凝膠上或在-20°C儲存直至使用。
10)對于對照反應,每泳道加30μL。

第六步.蛋白質印跡分析
注意:細胞裂解物泳道作為對照,以驗證蛋白質印跡是否正常運行。
1.
通過SDS-PAGE分離蛋白質,并轉移到硝酸纖維素膜上。
2.
在室溫下,將膜在含有5%牛血清白蛋白(BSA)的TBS-T中封閉1小時。
3.
準備在10mL5BSATBS-T中包含10μLHuR抗體(36kDa)的溶液。
4.
在室溫下將膜在抗HuR抗體中孵育4小時,或在4°C過夜。
5.
TBS-T清洗膜5次,每次5分鐘。
6.
將山羊抗小鼠IgGH + L)(HRP共軛,120,000)稀釋到含有5BSATBS-T中。
7.
將膜在稀釋的山羊抗小鼠IgG中于室溫孵育1小時。
8.
TBS-T清洗膜5次,每次5分鐘。
9.
將膜與化學發光底物在室溫下孵育(例如,SuperSignal West Pico化學發光底物)。
10.
立即將膠片暴露在X射線膠片或CCD相機上進行適當的曝光。





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