操作指南

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                                      外周血的淋巴細胞是一種已成熟的不具有進行有絲分裂能力的細胞,故不能直接用其制備染色體標本。但淋巴細e胞在植物凝集素(PHA)的刺激下,能轉變為具有細胞分裂能力的母細胞。因此,外周血必須經過含有PHA的培養液培養后,才能制備供核型分析染色體標本。


                              1 試劑

                              (1)淋巴細胞培養液配制

                              RPMI1640液     80%

                              小牛血清            20%

                              PHA                  適量(根據廠家說明書的使用量)

                              肝素                  100單位

                              雙抗                  100單位/毫升

                                                細胞生長因子     適量

                                      最后將配好培養液的酸堿度調PH=7.2-7.4,在無菌的條件下進行配制分裝。然后進行分裝,每瓶4.5毫升,-20℃保存。

                              (2)10μg/ml 秋水仙素;
                              (3)0.075M 低滲液: 2.795g KCl + 500ml 蒸餾水
                              (4) 固定液 ——甲醇:冰醋酸=3:1(該試劑必需現配現用)


                              2 采血與細胞培養

                                      用無菌注射器吸取0.2%肝素液0.2毫升(或100單位肝素)濕潤針筒,抽取被檢者靜脈血約2毫升,輕輕轉動針筒,使之與肝素混勻,再將解凍至37℃的培養液的瓶蓋用酒精棉球擦凈消毒,直接用注射器從瓶蓋上插入,每瓶接種0.2-0.4毫升的外周血,搖勻后于37℃培養箱培養,如果外周血樣本不需要保留,注射器不需吸取肝素,直接抽血,立即接種到培養瓶內,搖勻后培養。這一方法減少污染機會,同時降低肝素的用量(培養液中已含肝素),肝素量過大,會引起溶血。


                              3 制備中期染色體

                              3.1 秋水仙素處理

                                    加秋水仙素的時間根據檢查目的而定。如果檢查放射損傷后染色體畸變應在培養44-54小時后加秋水仙素,這樣可避免一部分畸變的染色體丟失;如果用于染色體疾病的診斷,則在培養66-70小時加秋水仙素,以積累更多的分裂中期細胞。 

                                   加入秋水仙素搖勻后,置37℃培養箱繼續培養4-6小時,終止培養收集細胞。

                              3.2 低滲處理

                                    將培養物倒入10毫升的刻度離心管內,平衡離心、離心速度1000-1500轉/分,時間8-10分鐘。小心吸去上清,加入8毫升預熱37℃的低滲液,用吸管將現溶物打勻,置37℃水浴15-20分鐘。使白細胞膨脹,染色體分散,紅細胞解體。

                              3.3 預固定

                                    低滲后,立即加入1毫升新配的固定液,輕輕打勻,1000-1500轉/分,離心8-10分鐘。3.3 固定

                                    離心后棄上清,留下管底的細胞,緩慢加入固定液約8毫升并輕輕打勻,37℃水浴30分鐘;第一次固定時,先加數滴,輕輕將細胞打勻,再慢慢加至8毫升,打勻,這樣染色體標本的形態較好。1000-1500轉/分,離心8-10分鐘。

                              3.4 再固定

                                   離心后,棄上清,加入8毫升固定液,打勻。于37℃水浴30分鐘,平衡離心、離心速度1000-1500轉/分,時間8-10分鐘。

                              3.5 制片

                                   離心后,棄上清,根據沉淀的細胞量,加入適量的固定液打勻,將細胞懸液滴入1-2滴于預凍的干凈玻片中央,隨即吹氣,輕輕過火,空氣晾干。

                              注意事項

                              ①器皿洗滌一定要干凈,不能有酸堿殘留。

                              ②接種外周血不能太多或太少

                              ③培養細胞溫度37±0.5

                              ④秋水仙素一定要避光保存,配制后使用期不能超過半年,秋水仙素的處理時間不要少于4小時,也不要超過6小時。

                              ⑤低滲的時間、溫度會影響染色體的分散和分裂相的數目。

                              ⑥離心機最好用水平式,轉速過快過慢直接影響標本片的質量。

                              ⑦固定液一定要現用現配,固定要徹底,每次不少于30分鐘,加固定液不能過快,要沿管壁慢慢加入,否則染色體容易扭轉;固定作用不足,染色體出現毛刷狀。

                              ⑧玻片的清潔度、冷凍溫度會影響染色體的鋪展。




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